潮州地区原发性高血压患者抗高血压药物相关基因多态性分析
林芬,吴泳浩,许嘉欣,张琳,杨立业△
南方医科医院中心实验室
原发性高血压(EH)是我国最常见的慢性疾病之一,是导致冠心病、脑卒中等心脑血管疾病的重要危险因子。根据世界卫生组织报道,在中国18岁及以上成年人中,EH发生率为19.8%[1],通过药物控制血压并减少EH所致并发症是主要的治疗目标。
临床实践表明,不同个体在接受同一种药物治疗时,治疗效果及其对药物的耐受性等方面存在着明显差异,这种差异也表现在药物的代谢、转运等不同阶段,遗传多态性是造成人与人之间药物反应个体差异的本质原因[2]。
三类抗高血压药物(β1受体阻断剂、血管紧张素Ⅱ受体抑制剂、血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂)相关基因[细胞色素P家族成员2C9(CYP2C9)、β1-肾上腺素能受体(ADRB1)、血管紧张素Ⅱ受体1(AGTR1)、细胞色素P家族成员2D6(CYP2D6)和ACE]的多态性位点CYP2C9:c.AC、ADRB1:c.GC、AGTR1:c.AC、CYP2D6:c.CT和ACE:I/D与治疗EH常用药物的疗效紧密相关[2]。
潮州地区的饮食、起居、文化和生活习惯自成一体。据调查,潮州地区18岁以上居民的EH发生率为18.29%[3],以潮州地区EH患者为研究对象,了解上述5个基因位点在人群中的分布情况,为抗高血压药物在本地区不同基因型人群中的合理使用提供理论和实验依据。
1资料与方法1.1一般资料
收集年3月至年4月在该院就诊的例EH患者,年龄36~89岁,其中男性例,平均年龄(61.19±12.07)岁,女性例,平均年龄(61.51±11.21)岁。根据年《中国高血压防治指南》中规定的诊断标准[4],EH为连续3次非同日坐位测量收缩压≥mmHg(18.7Kpa)或舒张压≥90mmHg(12.0Kpa)。
所有研究对象间均无血缘关系,EH患者入选标准为高血压3级,无心、脑、肾、肺或其他任何主要人体器官实质性改变。排除标准为已知的慢性肾脏疾病、1型或2型糖尿病、脑血管病史、冠状动脉粥样硬化性心脏病、妊娠和已知精神病史。
1.2仪器与试剂
DYY-6C型双稳定时电泳仪购自北京六一生物科技有限公司,Tanon全自动数据凝胶成像系统购自上海天能科技有限公司,Nano-DropOne核酸蛋白浓度测定仪购自美国热电Ther-mo赛默飞世尔公司,LifeExpress96孔PCR仪基因扩增仪购自杭州博日公司,ABIPrismXLDNA测序仪购自美国ABI公司。外周血基因组DNA提取试剂盒为深圳亚能生物技术有限公司生产,用于PCR扩增的2×TaqPCRMasterMix为北京艾德莱生物科技有限公司产品。
1.3方法
1.3.1基因组DNA提取采集患者乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝血5mL,按试剂盒的操作步骤提取基因组DNA,于-20℃保存。
1.3.2引物设计及扩增针对CYP2C9:c.AC、ADRB1:c.GC、AGTR1:c.AC、CYP2D6:c.CT和ACE:I/D基因多态性位点,使用Prime3软件设计5对引物用于扩增,详细序列见表1,引物由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR反应体系为2×MasterMix12.5μL、正反向引物各1μL、基因组DNA2μL,用灭菌双蒸水补至25μL。5对引物反应条件如下:95℃预变性3min;95℃变性30s,60℃复性30s,72℃延伸50s,共35个循环;72℃延伸10min。
1.3.3基因多态性位点的检测ACE:I/D基因扩增产物用2%琼脂糖凝胶,V下电泳30min,在Tanon全自动数据凝胶成像系统下鉴定基因型。以bpDNA标志物I为参照,PCR产物扩增出bp的DNA片段为I型,扩增出bp的DNA片段为D型,构成3种基因型,仅有bp条带者为插入型纯合子(II型),仅有bp条带者为缺失型纯合子(DD型),同时出现bp和bp两条带者为杂合子(ID型)。
CYP2C9:c.AC、ADRB1:c.GC、AGTR1:c.AC和CYP2D6:c.CT基因位点的PCR扩增产物送上海英骏生物技术有限公司直接测序,结果通过网站
