基于生物靶标网络分析的山豆根
抗乙肝病毒的作用机制初步研究
山豆根是一味常用于治疗乙肝的中药，在改善症状、保肝降酶、利胆退黄等方面疗效确切，但其抗乙肝病毒的作用机制尚不明确。为此，基于系统生物学的思想，通过整合网络药理学与代谢组学两种技术，较为系统的分析山豆根抗病毒的主要作用机制。首先，通过预测山豆根中主要化学成分的作用靶标，建立山豆根的“药物成分-靶标”网络；其次，以人肝癌细胞HepG2.2.15为研究对象，通过代谢组学技术分析山豆根抗乙肝的主要代谢过程和其主要影响的代谢物；最后，通过构建“药物成分-靶标-代谢物”网络，分析山豆根抗乙肝的主要作用靶标及代谢物，进而阐明其主要作用机制。山豆根可能主要作用于16个靶标蛋白发挥抗乙肝病毒作用，其作用机制可能与调节视黄醇代谢、过氧化物酶体增殖物激活型受体信号通路、癌症中的转录失调等过程有关，从而达到控制乙肝病毒复制、调节机体免疫和代谢功能紊乱等作用。
山豆根的制备
称取山豆根饮片g，置于1L圆底烧瓶中，加入6倍量的水加热回流提取2次，每次1h，合并2次滤液，以r·min-1离心20min，上清减压浓缩至原体积的1/10，再以r·min-1离心30min，去除残渣，上清液冷冻后置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥48h后，取出放置干燥器中以备使用[8]。所得提取物通过紫外光谱对总生物碱含量进行检测，测得水提物的总生物碱含量为6.98mg·g-1。
细胞培养
将HepG2.2.15细胞接种于DMEM混合培养基中（含10%胎牛血清、μg·mL-1G、1%青霉素和链霉素），置于5%CO2培养箱中培养。取对数生长期的细胞，按照每毫升1×个接种于96孔板中，每孔μL，培养箱孵育24h，弃上清液。实验组分别加入含有不同药物浓度的完全培养基，对照组添加等量完全培养基，37℃，5%CO2培养箱中继续培养12h，弃上清液，每孔加入10%CCK-8完全培养基，再次置于反应箱2h，酶标仪检测各孔吸光度（A），检测波长nm。按照公式得到细胞存活率（SR），以最大无毒剂量应用于后续实验。SR=（A实验组－A空白组）/（A对照组－A空白组）×%。取长满培养瓶的HepG2.2.15细胞，以胰酶消化2min，弃消化液，加培养液轻轻吹打。调整细胞数为6×个/mL，接种于细胞培养板，6孔板每孔2mL，5%CO2培养，贴壁后药物组加入最大无毒剂量的山豆根提取物，对照组添加等量完全培养基，给药3天，收集样品。
样品收集与处理
细胞培养完成后，收集上清，采用实时荧光定量PCR法对HBVDNA进行检测，细胞则以PBS洗涤2次，再使用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液（0.8mL）消化后，常温离心（r·min-1，3min），去除上清液，再使用等渗PBS（2mL）洗涤3次，最后用PBS重悬至1mL，r·min-1离心5min，弃去上清液，重悬于0.5mL预冷的超纯水，涡旋20s，冰浴10min，然后按超纯水与乙腈体积1:3沉淀蛋白，再次涡旋20s，4℃下静置10min，005r·min-1离心10min，取上清液于1.5mL离心管而后置于－80℃冰箱保存。
代谢组学检测
将处理好的样品经0.22μm针头滤膜过滤，滤液采用AgilentQ-TOF液质联用仪进行检测。液相采用AgilentHPLC，流动相A：含0.1%甲酸的纯水；流动相B：含0.1%甲酸的纯乙腈，流速为0.3mL·min-1，色谱梯度为：0～1min5%B，1～9min5%～40%B，9～19min40%～90%B，19～21min90%～%B，21～25min%B。取各样品少量，混合后作为质控（Qualitycontrol，QC）样品，每检测5样品运行1个QC。
结论
图1的生物靶标网络进行简化，提取与代谢标志物相关的山豆根作用网络见图2，其中包括山豆根的药物作用靶标（浅蓝色节点）8个：甲状腺素运转蛋白（TTR，P）、视黄酸受体α（RARα，P）、细胞色素P、氧化酶2C8（CYP2C8，P32）、维生素D3受体（VDR，P）、乙醇脱氢酶3（ADH5，P）、视黄酸受体α（RXRα，P）、过氧化物酶体增生物激活受体γ（PPAR-γ，P）、过氧化物酶体增生物激活受体α（PPAR-α，Q）；山豆根可作用的乙肝疾病靶标（黄色节点）9个，包括：酰基辅酶A（O）、α2-巨球蛋白（P）、载脂蛋白E（P）、载脂蛋白C（P）、乙醇脱氢酶5（P）、DNA拓扑异构酶IIα（P）、乙醇脱氢酶3（P）、乙酰胆碱酯酶（P）和极低密度脂蛋白受体（P）。采用DAVID软件对上述靶标进行通路富集分析，结果表明山豆根对乙肝的干预作用可能主要通过调节视黄醇代谢、PPAR信号通路、癌症中的转录失调、药物代谢细胞色素P酶和脂肪细胞因子信号通路等过程实现。
来源：药学学报
责编：何雨阳
审稿：褚夏燕
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